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Western-Blot试剂配制

关键词： western-blot western blot 试剂配制来源：互联网

（一）母液

1. 1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g 蒸馏水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 PH HCl 7.4 约17ml 7.5 约16m 7.6 约15ml

8.0 约10ml

2. 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g 异丙醇 100ml

溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。

3. 0.2mol/L NaH 2 PO 3 NaH 2 PO 4 （MW119.98） 12g 蒸馏水至 500ml

溶解后，高压灭菌，室温保存。

4. 0.2mol/LNa 2 HPO 3 Na 2 HPO·12H2O （MW 358.14） 71.6g 蒸馏水至 1000ml

溶解后，高压灭菌，室温保存。

5. 10 ％SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml

50℃ 水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

6. 10 ％过硫酸胺（AP）过硫酸胺 0.1g 超纯水 1.0ml

溶解后，4℃保存，保存时间为1周。（可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可）

7. 1.5mol/L Tris·HCl （pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g 超纯水 200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。

8. 0.5mol/L Tris·HCl （pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g 超纯水 200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。

9. 30 ％(w/v)丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 29g 甲叉双丙烯酰胺 1g

加去离子水，定容至 100ml 调整溶液 pH 值不超过 7.0，置棕色瓶中贮存于室温

10. 20 ％Tween20 Tween20 20ml 蒸馏水至 100ml

混匀后4℃保存。

（二）使用液单去污剂裂解液（PMSF）： 1mol/L Tris·HCl （pH8.0） 2.5ml NaCl 0.438g TritonX-100 0.5ml 蒸馏水至 50ml

混匀后4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。

一般实际用的比较多的其实是RIPA裂解配方： 50 mM Tris-HCl pH 7.4 150 mM NaCl 1 mM PMSF （用前加） 1 mM EDTA 1% Triton x-100 1% 脱氧胆酸钠 0.1% SDS 0.01mol/L PBS （ pH 7.2-7.4） 0.2 mol/L NaH 2 PO3 19ml 0.2 mol/L NaHPO 3 81ml NaCl 17g 蒸馏水至 2000ml （如果用TBST进行洗膜的话，其实PBS用得很少，大可不必自己配制，向试剂公司购买20×的PBS浓缩液即可，500ml的浓缩液不到50元，很方便） G250 考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）考马斯亮蓝G250 100mg 95 ％乙醇 50ml 磷酸 100ml

蒸馏水至 1000ml

配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。 0.15 mol/L NaCl NaCl （MW58.44） 0.877g 蒸馏水至 100 ml 高温灭菌后，室温保存。 100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA） BSA 0.1g

0.15 mol/L NaCl 1ml

溶解后-20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，-20℃保存。还原型 5XSDS 上样缓冲液 0.5 mol/L Tris·HCl （pH6.8） 2.5ml 二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g SDS 0.5g 溴酚蓝 0.025g

甘油 2.5ml

混匀后，分装于 1.5ml 离心管中，4℃保存。电泳液缓冲液 Tris （MW121.14） 3.03g 甘氨酸（MW75.07） 18.77g SDS 1g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存，次溶液可重复使用 3～5 次。（电泳液可以回收重复利用，一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鲜的电泳缓冲液）

（可以配制成 10×电泳缓冲液进行保存，稀释 10 倍使用）

转移缓冲液半干 24mmol/L Tris （ MW ： 121.14 ） 1.4536 g 192mmol/L 甘氨酸（ MW ： 75.07 ） 7.20672 g 20 ％甲醇 100 ml 蒸馏水至 500ml 浸渍（湿转） 48mmol/L Tris 2.375g 39mmol/L 甘氨酸 11.25g 20 ％甲醇 200ml 0.0375 ％ SDS 0.375g 蒸馏水至 1000 ml 溶解后室温保存，次溶液可重复使用 3～5 次（次溶液最好保存在 4 度冰箱，最多使用 5 次左右，不然影响转移效率）。（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris 和 SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris 和 SDS 等比较困难）

（可以配制成 2×转移缓冲液进行保存，稀释后使用）

10X 丽春红染液丽春红 S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 蒸馏水至 100ml TBS 缓冲液 1 mol/L Tris·HCl （pH7.5） 10ml NaCl 8.8g

蒸馏水至 1000ml

（可以配制成 10×TBS 缓冲液进行保存，稀释 10 倍使用） TBST 缓冲液 20 ％Tween20 1.65ml TBS 700ml 混匀后即可使用，最好现用现配。封闭液脱脂奶粉（国产） 5g TBST 100ml

最好现用现配。

洗脱抗体缓冲液 14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β- 巯基乙醇) 700 μl （通风厨里加） SDS 2g 0.5mol/L Tris·HCl （pH6.8） 12.5ml 超纯水至 100ml 配制时，在通风厨内进行。4℃保存。可重复使用 1 次。（可用可不用）显影液（5X）自来水（加热至 50℃） 375ml （以下药品加到温水中）米吐尔 1.55g 亚硫酸钠（无水） 22.5g 碳酸钠（无水） 33.75g 溴化钾 20.95g 补水至 500ml 配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4℃保存。使用时用自来水稀释至 1 倍。

（不需要自己配制，有钱的直接买柯达的显影液，上千；没钱的到专业的照相器材市场购买即可，很便宜，一包 5 毛钱左右）

定影液自来水（50～60℃） 700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）硫代硫酸钠 240g 亚硫酸钠（无水） 15g 冰乙酸 12.6ml 硼酸 7.5g 钾明矾 15g （水温冷至 30℃以下时再加入）加水定容至 1000ml，室温保存。（不需要自己配制，有钱的直接买柯达的定影液，上千；没钱的到专业的照相器材市场购买即可，很便宜，一包 5 毛钱左右）化学发光试剂分 A 和 B 两种试剂，有钱可以购买 Amersham、Pierce 或者 Santa Cruz 的，没钱的话国产的也能凑合。

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