临床样本DNA模板的常规制备方法
一、 病毒标本中提取DNA(支原体、腺病毒)处理方法
(1)将擦拭过的咽拭纸放入1.5ml装有1ml生理盐水的eppendorf管中。
(2)以10,000r/min离心5分钟,去上清液。
(3)沉淀物加入30 ml TE液混匀后煮沸10分钟,4℃保存备用。
二、 从细菌中提取DNA
1.NG(淋球菌)DNA的提取
标本可取自尿道、生殖道或结膜分泌物。
(1)取男性尿道口或女性宫颈处分泌物于事先加有1ml生理盐水的eppendorf管内。
(2)振荡棉签或拭纸使NG释放出来。
(8)加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA。
(9)去乙醇,空气干燥后加入30μl的TE液,置4℃冰箱保存备用。
2.TB(结核杆菌)DNA的提取
临床标本可来源于痰、尿、支气管灌洗液、胸水、腹水、心包积液等。处理方法也不尽相同,除痰标本外,其他标本大致相同。注意痰标本的留取一定要取次日早上的晨痰,留存器皿要无菌消毒,避免污染。
(1)痰标本TB DNA的提取
①挑少许痰液放入1.5ml的eppendorf管中,加入5mo1/L NaOH 500μl混匀,使痰液变稀,室温中摇动20分钟。
②加入1mo1/L NaH2 PO4 600μl混匀(起中和作用),10,000r/min离心5分钟。
③去上清液,补加TE至500μl混匀,加少许溶菌酶。
④置37℃消化30分钟。
⑤加等体积的酚、氯仿、异戊醇(25:24:1)混合液,摇匀20分钟。
⑥10,000r/min离心5分钟,将上清液移至另一干净eppendorf管中,加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液,继续摇匀20分钟。
⑦10,000r/min离心5分钟,移上清液于另一小管中,加入等体积异丙醇摇匀。
⑧10,000r/min离心5分钟,去上清液,置空气中干燥,加入30μlTE溶解沉淀物,置4℃冰箱备用。
(2)胸水、腹水、支气管灌洗液、尿液、心包积液标本TB DNA的提取
①将上述液体3ml,经反复离心,去上清液,留沉淀物。
②按上述痰标本处理操作步骤③-⑧提取。