实验三十二 光电比浊计数法

　　一、目的要求

　　1．了解光电比浊计数法的原理。

　　2．学习光电比浊计数的操作方法。

　　二、基本原理

　　细菌菌体是不透光的，光束通过细菌悬液，将会由于被散射或被吸收而降低其透过量。细菌悬液的浓度同光密度成正比，同透光度成反比，而光密度或透光度可以借光电池精确测出。所以可用光电比浊计来测定细菌相对数目。可先用血球计数板计数，再将菌悬液分别稀释调整为每毫升含不同的菌数，通过分光光度计分别测定其光密度（尽量控制光密度值在0．1—0．65之间，以得到较高精确度）。然后以光密度（OD）作纵坐标，以每毫升不同菌数为横坐标绘制标准曲线。再将待测菌悬液适当稀释，同法进行比浊测定，根据所测光密度值就可以从标准曲线上查得每毫升的细菌数。此法简便、迅速，可以节省许多稀释平板计数法的时间，便于在生产实践中控制细胞的数目。但颜色太深的样品或在样品中还含有其他物质的悬液，不能用此法测定。

　　三、器材

　　酿酒酵母培养液，72型或721型分光光度计，血球计数板，显微镜，试管，吸管，吸水纸，无菌生理盐水等。

　　四、操作步骤

　　1．标准曲线制作

　　(1)编号取无菌试管7支，分别用记号笔将试管编号为1、2、3、4、5、6、7。

　　(2)调整菌液浓度用血球计数板计数酿酒酵母培养液，并用无菌生理盐水分别稀释调整为每毫升1×106 、2×106 、4×106 、6×106 、8×106 、10×106 、12×106 的细胞悬液。再分别装入已编好的1至7号无菌试管中。

　　(3)测OD值将1至7号不同浓度的菌悬液，摇匀后于560nm波长，1cm比色杯中比色测定OD值。比色时，用无菌生理盐水作空白对照，并将OD值填入下表。

　　(4)以光密度（OD）为纵坐标，每毫升细胞数为横坐标，绘制标准曲线。

　　2．样品测定

　　 将待测的样品用无菌生理盐水适当稀释，摇匀后，用1cm比色杯，560nm波长测定光密度。测定时用无菌生理盐水作空白对照。

　　3．根据所测光密度值，从标准曲线查得每毫升的菌数。

　　五、实验报告

　　1．结果

　　每毫升样品菌数=查得数×稀释倍数。

　　2．思考题

　　（1）微生物光电比浊计数的原理是什么？这种计数法有何优缺点？

　　（2）微生物光电比浊计数法在生产实践中有何应用价值？