外周血单个核细胞的分离实验
实验方法原理
体外测定免疫细胞的数量和功能常需将某种免疫细胞首先分离出来。本实验是采用密度梯度离心法分离单个核细胞(mononuclear cell)。单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞(monocyte)。 血液中各种细胞的大小和比重不同,因此,可用不同比重(密度)的分离液使不同比重的细胞在离心沉降过程中按相应密度梯度分布,从而达到分离各种细胞的目的,入单个核细胞的比重为 1.075~1.090,而红细胞、粒细胞等的比重在 1.092 左右,因此,将血液轻轻加在比重为 1.076~1.078 的分离液上,使成一界面,再经离心,即出现分层,最上面为血浆层,界面处有一白色云雾状细胞层即为淋巴细胞和单核细胞,而红细胞和粒细胞则沉于管底。分离液的比重受温度变化的影响,实验应在室温(20 ℃)下进行,若实验时,室内温度低于 20 ℃ 则先将分离液在 37 ℃ 水浴中高于 20 ℃ 的夏季,得率可能偏低。
实验材料 人静脉血(每毫升血用 20 单位肝素抗凝)
试剂、试剂盒 聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-lsopaque)淋巴细胞分离液(比重 1.077±0.001)Hanks 液95% 甲醇水溶液Jenner(May-Grunwald)染液Giemsa 染液95% 乙醇
仪器、耗材 圆底小试管1 ml 或 2 ml 吸管毛细吸管载玻片水平式离心机
实验步骤
1. 加淋巴细胞分离液 2 ml 于圆底试管中。
用吸管直接伸入试管底加入,以防分离液沾上试管壁。
2. 于另一试管中,加静脉抗凝血(每毫升血加 20 单位肝素)2ml,再加等量 Hanks 液将血液稀释。
3. 用毛细吸管将此抗凝稀释的血液沿管壁徐徐加入分离液试管中,使与分离液形成一界面,两者不能混合。
4. 离心
室溫(20 ℃)下于水平离心机中,2000 r/min 离心 20min。
5. 取出试管,此时可见试管内已分层,用一毛细吸管插入界面白色细胞层,吸出细胞,移入另一试管内。
6. 加入 1 ml Hanks 液,悬浮细胞。
7. 制片
7.1 取一滴细胞悬液于一干净载玻片的一端,用另一边缘光滑的玻片按「吞噬作用」实验的方法推片。
7.2 干燥、固定 于空气中自然干燥,然后用 95% 甲酵固定 2 min。
7.3 染色将涂片浸于 0.25% Jenner 染液中 5~10 min,再移到 1:20 Giemsa 染液中 20min,用水冲洗。
7.4 脱色 用 95% 乙醇脱色 30 s,水冲洗。
8. 镜检
干燥后,在显微镜下观察单个核细胞的形态。若观察到细胞着色太蓝,可再脱色 30 s。