一、实验方法
1. 将切下的组织在手术台上请护士将标本放入低温生理盐水中(静止),在手术完成时将标本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中带回实验室。 2. 在超净台中将标本放入培养皿中,加入α-MEM 洗涤。 3. 获得组织切开,仔细辨认于关节反折处及增生的白色光滑的滑膜组织,附于关节软骨面的增生的血管翳也为滑膜组织(可作另一管消化),仔细剔除脂肪组织,用α-MEM 洗二次(以去除红细胞),放在小青瓶中用解剖剪锐性切碎。 4. 用双倍获得组织的体积含有4 mg/mlⅠ型胶原酶的α-MEM 消化37℃孵育120分钟(在此期间震动混匀数次)。 5. 30 分钟后收集第一管细胞:细胞悬液经70 um 细胞滤网过滤,用1500-2000转离心6分钟,上清为Ⅰ型胶原酶加入未过滤网的组织,继续用于消化。 6. 离心管底细胞用α-MEM 离心洗涤2 次,每次用α-MEM 重悬浮后用1500-2000 转,离心6 分钟,最后一次用记数板观察到有细胞。细胞最终悬浮于含有10%胎牛血清的α-MEM 中,接种到培养瓶中培养。 7. 60 钟后收集第二管细胞:细胞悬液经70 um 细胞滤网过滤,用 1500-2000 rpm 离心6 分钟;用α-MEM 洗2 次,每次用α-MEM 重悬浮后用1500-2000 rpm 离心6 分钟,最后一次用记数板观察细胞并计数。细胞最终悬浮于α-MEM 含有10%胎牛血清中,接种到培养瓶中培养。 8. 必要时可做第三管细胞收集;并立即作原代滑膜细胞培养。 9. 每 2-3 天换液一次。 展开 |