疾病检测新指标-miRNA(一)
microRNA(miRNA)是真核生物中广泛存在的一种由 non-coding 区域转录的小片段 RNA,长度仅有 19~25
个核苷酸。根据 miRBase 数据库,在所有物种发现的 miRNAs,至今已超过 2 万个。miRNA 透过与标的 mRNA
的特异性结合,经由 post-transcriptional 基因沉默的途径,抑制蛋白质生合成。推测脊椎动物的基因组中有超过1,000 个不同的
miRNAs,且有将近 1/3 的基因表现受到 miRNA的调控。
和 mRNAs 一样,在不同的组织或发育时期,miRNAs 的表现量也会不同。这些 miRNAs 在细胞生长与凋亡、细胞周期调控、细胞的分化以及个体的发育等过程中扮演重要角色。
在癌症、心血管疾病、糖尿病、神经系统疾病、发炎反应以及自体免疫疾病可观察到 miRNA 表达谱的改变。差异表达的 miRNA
也可能有助于区分疾病状态。miR2Disease 数据库以人工的方式整理了目前已知与人类疾病相关的 miRNA 表达异常(Jiang Q et
al., 2009)。分析肿瘤与正常组织,或是不同肿瘤型态之间 表现的差异,可以找到与癌症高度相关的 miRNAs。
miRNA 做为疾病检测生物标记
miRNAs
也存在于人类和其他动物的血清和血浆中,其种类和数量可随着生理状况或疾病而不同。生化分析显示,miRNA
可以抵抗血浆和血清中存在的核糖核酸酶、极端的 pH 值和温度、长期的储存以及反复的结冻解冻循环(Mitchell PS et
al.,2008)。利用循环血液中 miRNA 进行疾病诊断或预测疾病发生的非侵入式检测方式,成为近年来生物医学家的研究重点。最先将 miRNA
做为血液中生物标记的是关于 B 细胞淋巴癌(B-cell lymphoma)的研究,在卵巢癌与肺癌病人的周边血液中也发现高量的癌症相关
miRNAs。许多的研究报告都已说明 miRNA 作为肿瘤等疾病诊断与预测的生物标记之潜力。
在2009年,Ji等人发现,血浆生物标记还可以检测心脏的损伤。许多报告指出血浆中 miRNAs与心肌梗塞和心脏衰竭相关。虽然大多数关于疾病的血浆
miRN A检测研究使用 real-time PCR,Tijsen
等人用微数组方法筛选健康对照者与患有心脏衰竭的患者血浆中的miRNA表达差异(Tijsen AJ et al.,
2010)。他们的研究结果证明了以微数组平台检测血浆中miRNA的变化,做为心脏疾病的生物标记的可行性。
miRNA 做为感染早期诊断的指标
细菌的感染可能会引发严重的并发症,如败血症(Sepsis)与败血性休克(Septic shock)。高雄长庚医院杨家森医师等人(Hsieh CH
et al., 2012)检测血液中miRNA的变化,研究在临床上早期诊断细菌感染的可行性。将来自大肠杆菌血清型
026:B6(Escherichia coli serotype 026:B6)、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella
pneumoniae)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa )、沙门氏菌(Salmonella enterica
serotype Enteritidis)以及粘质沙雷氏菌(Serratia
marcescens)等革兰氏阴性菌的lipopolysaccharide(LPS)以腹腔注射的方式注射 4~6 周龄的小鼠,于 2~72
小时后牺牲小鼠,取得全血与肺脏、脑、肝脏、脾脏。萃取的 RNA 以华联小鼠&大鼠 miRNA 芯片(Mouse&Rat
miRNA OneArray®)分析 miRNA 的表现,与对照组(只注射PBS)相比有明显的不同(图1)。注射100-μg LPS
6小时后,在肺组织与全血均有15 种上调表现差异超过 2倍的 miRNAs。在大脑中则没有表现向上调控的 miRNA 。下调表现差异超过 2
倍的 miRNAs 数目较多,在肺、肝、脾和血液样本中分别有23, 10, 8, and 51种。大部分在血液中观察到的向下调控 miRNAs
并没有在其他组织中发现相似的情形。
以 real-time RT-PCR 验证血液中差异表现超过 4 倍的 8 种
miRNAs(let-7d, miR-15b, miR-16, miR-25, miR-92a, miR-103, miR-107, and
miR-451),在注射100 and 1000-μg大肠杆菌 LPS 6 小时后,miRNAs表现量增加 5~12
倍(图2A)。分析不同时间点的 miRNAs 变化,在注射后 2小时,miRNAs 表现量就有明显的增加,并且维持到至少 6 个小时;24
小时只剩 miR-25 和 miR-92a 有显著的差异表现,72 小时则与对照组无异(图2B)。
miRNAs 是免疫反应的重要调控因子,LPS诱导的 Toll-like receptor 4 (TLR4)
讯息传导(signal transduction)会活化与 nuclear factor-kappa B (NF-κB) and
activator protein 1 (AP-1) 相关的 pathways,生成许多与发炎反应有关的 cytokines,
chemokines, or leukocyte adhesion molecules。为了了解 TLR4 receptor 在调控miRNAs
表现中所扮演的角色,在 TLR4 receptor knockout小鼠体内注射100-μg LPS后6小时,let-7d, miR-25,
miR-92a, miR-103 and miR-107的表现量明显比正常C567BL / 6小鼠低(图3)。