分子克隆-蛋白表达实验指南(十四)
RbCl制备感受态细胞
需准备的灭菌器具和培养液:
SOB,Buffer 1,Buffer 2,3×200ml广口瓶,1.5ml
EP管,1×500ml离心瓶(按200ml摇菌量计算),2×50ml离心管,2×移液管(用于加Buffer 1),液氮,冰
离心管,EP管,移液管使用前均需要放在4C预冷。离心机使用前也应预冷
1.将DH5α(上批做好的感受态菌或保种的DH5a)划在LB平板上,370C培养10-12小时
2.挑单克隆于4ml SOB培养液(SOB培养液中的MgCl2 和MgSO4必须摇菌之前加,细菌活化也可以用LB培养液),370C培养过夜
3.取2ml过夜菌到200ml SOB培养液(1000ml三角椎瓶),370C培养至OD600=0.35(约1.5小时,OD最好不能超过0.4
4.将菌迅速置于盐冰浴上15分钟(盐使冰浴更冷,也可以不用盐冰浴),同时预冷500ml离心瓶和离心机
5.将菌分装于500ml离心瓶中,5000rpm,40C离心5分钟,弃上清
6.加入64ml Buffer1,小心的吹打细菌使之混匀(最好从瓶壁上离菌落3-4cm处吹下buffer
1,不要直接吹打菌落,冰上操作。加buffer1时先预加30ml,当菌落吹打均匀后再补加34ml
buffer),冰上15min。4800rpm,40C离心5分钟,弃上清
7.将菌平均分装于两个50ml离心管中,分别加入8ml
Buffer2,悬浮细胞,悬浮方法同step6,置冰上。立即分装为100ul/每管(1.5ml离心管需预冷,无菌操作)
8.分装好的感受态菌立即放入液氮中,-700C保存
SOB 200ml
Tryptone 4g
Yeast extract 1g
NaCl 0.12g
KCl 0.1g
Autoclave
用前加入 1M MgCl2 到 10mM
1M MgSO4到 10mM (MgCl2,MgSO4混合液过滤除菌)
Buffer1 64ml
RbCl 0.768g
MnCl2*4H2O 0.636g
CaCl2*2H2O 0.096g
Glycerol 9.6g
KAC 1.92ml of 1M stock PH7.5
0.2M Hac 调PH至5.8
0.22um过滤器灭菌,40C保存
Buffer 2 20ml
MOPS 0.4ml of 0.5M stock PH6.8 MOPS不能高压灭菌
RbCl 0.024g
CaCl2*2H2O 0.22g
Glycerol 3g
0.22um过滤器灭菌,40C保存
22.常用试剂配方:
LB液体培养基
Tryptone 1g
Yeast Extract 0.5g
NaCl 1g
加蒸馏水至总体积为100ml,高压蒸汽灭菌。
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