紫外-可见分光光度法测定汉麻果胶中总皂苷的含量
紫外-可见分光光度法测定汉麻果胶中总皂苷的含量
摘要:目的建立汉麻果胶中总皂苷含量的测定方法。方法以蕨麻苷Ⅱ号为对照品,5%香草隆冰醋酸和高氯酸的混合溶液为显色剂,采用紫外分光光度法在500衄处测定汉麻果胶总皂苷的含量。结果蕨麻苷Ⅱ号检测浓度在70~177ug与吸光度呈良好的线性关系(r=0.9993);平均加样回收率为99.0%,RSD=1.7%(n=6)。结论本方法简便,可操作性强,灵敏度高,是汉麻果胶总皂苷含量测定的一个切实可行的方法,为汉麻果胶有效部位的进一步研究提供依据。
关键词:汉麻果胶;总皂苷;蕨麻苷Ⅱ号;紫外-可见分光光度法
1仪器和试药
CarySO Bio紫外可见分光光度计(Varian AustraliaP1、Y LTP);AL204电子分析天平(梅特勒一托利多仪器有限公司);R501B旋转蒸发器;硅胶G板(规格:100 mm×200 mm,);
冰醋酸、高氯酸、甲醇等均为分析纯;香草醛为化学纯。汉麻果胶(取自鲜茎皮杆分离和干茎皮杆分离时脱下的粉状物质,云南军用汉麻材料研究中心);蕨麻苷II(解放军第302医院中药研究所制备并鉴定,其化学名称为:2α,3β,19β-三羟基-乌苏酸-28-O-β肛毗喃半乳糖苷,经HPLC归一化法计算纯度>98%)。
2方法
2.1对照品的选取
目前国内尚无汉麻果胶皂苷类成分的法定对照品,因此本实验对对照品的选取进行了研究。将汉麻果胶醇提液用D101大孔树脂进行初分离,依次用水,30%、70%、80%和95%的乙醇进行梯度洗脱,各洗脱液浓缩至干,加甲醇溶解,进行薄层层析,结果显示,当以本实验室自行分离制备的蕨麻苷Ⅱ为对照品时,经三氯甲烷一甲醇(8.5:1.5)展开之后,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇,于105℃加热至斑点显色清晰,发现在品值为0.32处,95%洗脱液部分与对照品出现相同的蓝紫色斑点,说明原药中存在与对照品相同或结构类似成分,因此选取蕨麻苷Ⅱ为对照品。
2.2对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的蕨麻苷Ⅱ对照品7 mg,置于2 mL容量瓶中,加甲醇定容,摇匀,使含蕨麻苷Ⅱ的浓度为3.5 mg·mL-1。
2.3供试品溶液的制备
称取汉麻果胶粉末1 kg,分别加入8、5、4倍量80%乙醇回流提取3次,每次1.5 h,合并3次滤液,于旋转蒸发仪上(65~70℃)回收溶剂至无醇味,加乙醇至含醇浓度为30%(相当于含有0.4 g原生药·mL-1),静置24 h,取上清液50 mL转移至蒸发皿中蒸干溶剂,用甲醇溶解,溶液转移至250 mL容量瓶中,并用甲醇定容,称重,超声20 min,放冷,再称重。用甲醇补足重量,摇匀,用0.45 um微孔滤膜过滤,取续滤液,备用。
2.4最大测定波长的选择
精密吸取对照品溶液25uL,供试品溶液200uL和甲醇25uL,分别置于10 mL具塞试管中,挥干甲醇,精密加入新配制的5%香草醛一冰醋酸与高氯酸混合溶液(2:8)2mL,密塞,摇匀。置于70℃水浴中加热15 min,取出立即用冰水冷却终止反应,精密加入乙酸乙酯5.0 mL稀释,摇匀,直接检测,以甲醇为空白,照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版第二部附录IVA)于400~800nm波长内进行扫描,结果对照品和供试品均在可见光区500 nm处具有最大吸收峰,故确定500nm作为测定波长,结果见图1。
2.5标准曲线的绘制
分别精密吸取蕨麻苷Ⅱ对照品溶液20、25、30、35、40、45、50uL,置于10 mL具塞试管中,挥干甲醇,按“2.4”项下方法操作,以甲醇为空白,照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版第二部附录ⅣA)在500 nm处测定吸光度,以吸光度A为纵坐标。蕨麻苷Ⅱ浓度C(ug)为横坐标绘制标准曲线,回归方程为:A=0.0046C-0.1436,r=0.999 3,吸光度与浓度在70~177ug呈良好的线性关系。