被分离组分在柱中的洗脱原理(一)
基本概念和理论
一、基本概念和术语
色谱图和峰参数
⊕色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器,所得到的信号-时间曲线,又称色谱流出曲线(elution profile).
⊕基线(base line)--流动相冲洗,柱与流动相达到平衡后,检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。
⊕噪音(noise)――基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
⊕漂移(drift)基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起,柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
⊕色谱峰(peak)--组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称性正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。不对称色谱峰有两种:前延峰(leading peak)和脱尾峰(tailing peak ).前者少见。
⊕拖尾因子(tailing
factor,T)--T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry
factor)《中国药典》规定T应为0.95~1.05。T<0.95为前延峰,T>1.05为拖尾峰。
⊕峰底――基线上峰的起点至终点的距离。
⊕峰高(Peak height,h)――峰的最高点至峰底的距离。
⊕峰宽(peak width,W)--峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=4σ。
⊕半峰宽(peak width at half-height,Wh/2)--峰高一半处的峰宽。W h/2=2.355σ。
⊕标准偏差(standard
deviation,
σ)--正态分布曲线x=±1时(拐点)的峰宽之半。正常峰宽的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小,分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高;反之,σ大,峰形胖、柱效低。
⊕峰面积(peak area,A)――峰与峰底所包围的面积。A=×σ×h=2.507σh=1.064Wh/2h
2.定性参数(保留值)
⊕死时间(dead time,t0)--不保留组分的保留时间。即流动相(溶剂)通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。
⊕死体积(dead volume,V0)――由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分:进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙(被流动相占据,Vm)、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程,其他3部粉只起峰扩展作用。为防止峰扩展,这3部分体积应尽量减小。V0=F×t0(F为流速)
⊕保留时间(retention time,tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。
⊕保留体积(retention volume,VR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR=F*tR .
⊕调整保留时间(adjusted
retention time,tR’)--扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间(reduced retention
time)。在实验条件(温度、固定相等)一定时,tR’只决定于组分的性质,因此,tR’(或tR)可用于定性。TR’=tR-t0
⊕调整保留体积(adjusted retention volume,VR’)--扣除死体积后的保留体积。VR=VR-V0 或VR=F*tR’
3.柱效参数
⊕理论塔板数(theoretical plate number,N)用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)。
N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布,N可近似表示为:
N=(tR/σ)2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2
W:峰宽 ; σ:曲线拐点处峰宽的一半,即峰高0.607处峰宽的一半。
N为常量时,W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上,如果各组份含量相当,则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽,峰高则逐渐降低。
用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用,因为半峰宽更容易准确测定,尤其是对稍有拖尾的峰。
N与柱长成正比,柱越长,N越大。用N表示柱效时应注明柱长,,如果未注明,则表示柱长为1米时的理论塔板数。(一般HPLC柱的N在1000以上。)
若用调整保留时间(tR’)计算理论塔板数,所得值称为有效理论塔板数(N有效或Neff)=16(tR’/W)