一、样品稀释液的制备
1. 准确称取待测样品10g,放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中,用手或置摇床上振荡20min,使微生物细胞分散,静置20~30s,即成10-1稀释液;再用1mL无菌吸管,吸取10-1稀释液1mL,移入装有9mL无菌水的试管中,吹吸3次,让菌液混合均匀,即成10-2稀释液;再换一支无菌吸管,吸取10-2稀释液1mL,移入装有9mL无菌水的试管中,也吹吸3次,即成10-3稀释液;以此类推,连续稀释,制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液。
2. 用稀释平板计数时,待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时,稀释度应高,反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时,采用10-7、10-8、10-9稀释度,测定土壤细菌数量时,采用10-4、10-5、10-6稀释度,测定放线菌数量时,采用10-3、10-4、10-5稀释度,测定真菌数量时,采用10-2、10-3、10-4稀释度。 二、平板接种培养
1.混合平板培养法:将无菌平板编上10-7、10-8、10-9号码,每一号码设置三个重复,用无菌吸管按无菌操作要求吸取1×10-9稀释液各1mL放入编号10-9的3个平板中,同法吸取10-8稀释液各1mL放入编号1×10-8的3个平板中,再吸取1×10-7稀释液各1mL放入编号1×10-7的3个平板中,由低浓度向高浓度时,吸管可不必更换。然后在9个平板中分别倒入已熔化并冷却至45~50℃的细菌培养基,轻轻转动平板,使菌液与培养基混合均匀,冷凝后倒置,在30℃下培养。至菌落长出后即可计数。
2. 涂抹平板计数法:涂抹平板计数法与混合法基本相同,所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中,待凝固后编号,然后用无菌吸管吸取0.1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上,每个编号设三个重复。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀,每个稀释度用一个灭菌刮铲,更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时,也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20~30min,使菌液渗透入培养基内,然后将平板倒转,保温培养,至菌落长出后即可计数。
三、分离方法
1.混菌法:按“稀释平板测数法”中的“混合平板培养法”进行,使用的稀释度为10-4、10-4、10-6三个,各做3个重复。
2. 涂抹法:按“稀释平板测数法”中的“涂抹平板测数法”进行,使用的稀释度为10-3、10-4、10-5三个,各做3个重复。
3.划线法:用灭菌接种环沾取10-1稀释液1环于已凝固的平板上进行划线(图示)。划线可按以下两种方式进行,一种为交叉划线法,是在平板的一边做第一次“Z”字形划线。转动培养皿70°角,将接种环在火上烧过并冷却后,通过第一次划线部分,做第二次“Z”字形划线。同法进行第三次、第四次划线。另一种为边疆划线法,是从平板边缘的一点开始,连续作紧密的波浪式划线,直至平板中央。转动培养皿180°,再从平板另一边(不烧接种环)同样划线至平板中央。划线法实质上属于一种“由点到线”的稀释法,较适用于含菌比较单一的材料的纯化,对于土壤这类微生物高度混杂的样品则较少使用。
四、培养 将上述接种过土壤悬液的平板倒置,于28~30℃培养,至长出菌落为止(24~36h)。
五、挑菌纯化
在平板上选择分离较好的有代表性的单菌落接种斜面,同时作涂片检查,若发现不纯,应挑取此菌落做进一步划线分离,或制成菌悬液再做稀释分离,直至获得纯培养体。
六、计数
选取混菌法和涂抹法中每皿菌落数30~300的平板,分别按“稀释平板测数法”中的“混合平板测数法”和“涂抹平板测数法”中的公式计数。这样求得的是每克原始土样中的活菌数,若要折算为每克干土的含菌数,还应将此数值除以干土在土样中所占的质量分数(烘干土的质量/原土样的质量)。 展开 |