酶联免疫检测技术的应用现状和发展前景
酶联免疫检测技术的应用
真菌毒素的检测:黄曲霉毒素 B 1 、 M 1 以及 T-2 毒素,脱氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素 DON ),二乙酰草镰刀菌烯醇( DAS ),玉米赤霉烯酮,赫曲霉毒素 A ( OA )。
农药的检测:主要有除草剂与杀虫剂两大类,例如杀暝松( FN )、甲氟磷酸异已酶( SOMAN )、草不绿( Alachor )、西维因( Carbaryl )、多菌灵及克菌丹( Captan )等。
其他类的检测:盐酸克伦特罗,河豚毒素,植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素,苯并( a )芘,抗生素,激素类以及一些营养物质和食品添加剂如麸蛋白( Gliaclin ),酱油蛋白( Soy protein ),花生蛋白( Peanut protein ),牛乳清蛋白( Borine Whey Protein )等。
随着食品工业的发展,对分析检测的要求越来越高,从而也使 ELISA 方法将更趋完善。一方面为提高 ELISA 方法的灵敏度和特异性,制备单克隆抗体的技术的发展,将和 ELISA 法互相结合,从而使食品卫生分析达到 DNA 分子结构水平,促使食品工业的健康发展。
1 放射免疫分析(RIA)
放射免疫法(Radioimmunoassay,RIA)优点是特异性强、灵敏度高、精确、简便易行。它包括以标记抗原(Antigen, Ag)为特点的放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)和以标记抗体(Antibody, Ab)为特点的免疫放射分析(Immunoradiometric assay ,IRMA)。前者以液相竞争结合法居多,既测大分子抗原又测小分子抗原;后者以固相法测大分子抗原为主。
最早建立的农药免疫法中,RIA占了很大比重,建立了狄氏剂、艾氏剂、2,4-D和2,4,5-T、对硫磷和百草枯等农药的放射免疫法。但由于进行RIA需使用昂贵的计数器,存在放射性防护和废物处理等问题,其应用受到较大限制。1982年后发表的农药免疫分析文章,主要是酶免疫分析法。
2 酶免疫法(EIA)
酶免疫法(Enzyme Immunoassay, EIA)是将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫分析方法。酶免疫法的检测原理与放射免疫法类似,通过测定结合于固相的酶的活力来测定被测定物的量。用作标记物的酶有辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)和碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)。酶标试剂制备容易、稳定、价廉。酶免疫分析的灵敏度接近放射免疫技术,而可借助于简单的仪器作定量测定,是目前农药监测中应用最广泛的免疫分析技术。
EIA法包括酶联免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)、酶免疫试验法(Enzyme-monitored Immunotest , EMIT)、竞争结合酶免疫分析法(Competitive Binding Enzyme Immunosorbent Assay, EIA)和免疫酶分析法(Immunoenzymometric Assay, IEMA)。其中基于竞争吸附的ELISA已成为农药监测中的首选方法。
美国环境保护机构(USEPA)开发了野外便携式和实验室ELISA方法,其主要目标是建立便于野外监测危险污染物的简便方法。监测的靶分析物包括多氯联苯、苯、甲苯和二甲苯混合物、硝基芳烃化合物、对硫磷、carbaryl和其它杀虫剂。美国食品药物管理局(USFDA)主要将ELISA集中于食品和饲料中农药残留的检测,开发了天然霉素(黄曲霉素)的免疫分析,目前正在研究用于检测phenamaphos和carbendazine 等化合物的检测方法。美国农业食品安全检查部门(USFSIS)资助开发了除草菊酯、有机氯杀虫剂及其它化合物的免疫分析法,并采用现有的方法来完成其监测任务。
近年来,Immunosystems Inc.已生产出了几种ELISA试剂盒,其靶分析物包括杀虫剂、杀菌剂和除草剂。这种试剂盒配上便携式分光光度计可实现野外定量快速测定,检测灵敏度为0.03~25ppb。便携式ELISA试剂盒检测程序见图1。 随着ELISA在农药监测中的应用范围的不断扩大,一些新方法也不断涌现。Hall等用EIA法检测了水样中的污染物2,4-D,三嗪,Merolachlor并将其与气相色谱分析结果进行比较。Roda [4] 等利用EIA对环境水样中苯并芘进行了测定。 Hong利用ELISA对土壤和水中三氮杂苯类除草剂进行了测定。Hutchinson等利用ELISA检测土壤中的EPTC。Wittmann用酶免疫分析法检测残留在食品中的三嗪。Weller [5] 通过改变温育时间,提高了ELISA检测三氮杂苯类除草剂的灵敏度。我国的研究者也自行开发了一些ELISA法。刘长武 [6] 应用ELISA对梨、苹果中的对硫磷残留进行了测定。余万俊 [7] 制备了杀虫脒的特异性抗体,并以此抗体建立了大米中杀虫脒残留的单克隆抗体ELISA检测法。阳传和 [8] 应用B淋巴细胞杂交瘤技术,研究出特异性强的T-2毒素的单克隆抗体,并建立了小麦T-2毒素的ELISA方法。周永新等 [9] 进行了蓖麻毒素多克隆抗体的研究。 ELISA的快速发展,主要是由于其高度的重现性、灵敏度和较短的分析时间所决定的。许多环境化合物的特异性单克隆和多克隆抗体的制备及应用为ELISA的快速发展奠定了基础。 3 荧光免疫分析(FIA) 本世纪40年代,Coons采用荧光素标记抗体检测可溶性肺炎球菌多糖抗原,首次创建了荧光抗体检测技术。荧光免疫法具有专一性强、灵敏度高、标记物不易失活、价格低廉、无放射性污染等优点。至今,FIA已广泛应用于微量、超微量物质分析测定。FIA常用的荧光素有异硫氰酸酯(Fluoresceine isothiocyanate , FITC)和罗丹明(BLissamine Rhodamine B200, RB200)等。将荧光免疫与光纤传感器结合形成的荧光免疫传感器是近年来荧光免疫法研究十分活跃的领域。荧光免疫传感器是将抗体(抗原)固定在适当基底上,实现生化荧光信号向光电信号的转变,以对待测物质进行定量检测。测定环境中农药残留的分子识别元件可以是AchE [10] 抗体 [11] 和碱性磷酸酶等。 Rogers等 [12] 将FITC标记的AchE固定在石英纤维上以检测酶的活性。乙酰胆碱水解时产生的H + 猝灭纤维表面的荧光信号,荧光强度减弱。有机磷农药抑制AchE的活性,从而降低荧光猝灭能力,可检测溶液中10 -8 mol . L -1 的AChE抑制剂,其响应时间小于1min。Anis等将有机农药对硫磷抗体和FITC标记的Anti-IgG Ab蛋白固定在石英纤维上制得荧光免疫传感器。测定对硫磷的检测限为10 -9 mol . L -1 。Schulman利用竞争性荧光能量转移法原理,用FITC标记的多克隆氯乙异丙嗪(atrazine)抗体,用四甲基罗丹明标记农药氯乙异丙嗪,研制出光纤免疫传感器,通过增加能量转移的量改善了灵敏度。Northrup [13] 利用光纤免疫传感器检测农药中拟除虫菊酯(pyrethroide)。Bier等 [14] 以荧光和损耗波作用为基础,研究了光纤传感器对三嗪衍生物terbutryn的灵敏度和再生性,检测限0.1ng/mL,可稳定使用8周以上并可循环测定500次。Robert等 [15] 应用损耗波光纤为基础的免疫传感器还可直接检测地面水中ng/mL水平的蓖麻毒素。这类传感器有很高的特异性,然而对分子量小的有机磷农药,特别是有机磷神经性毒剂,较难诱导出高质量的抗体,加之生物材料在固定化过程中的可能失活等原因使其应用尚不及EIA普遍。目前国内尚无此类工作报道。 荧光免疫分析中的其它发展还有时间分辨荧光多组份免疫分析法的建立及时间分辨荧光免疫分析中荧光效应的研究。 |