PCR实验常见问答
常见问答
Q-1:
LA PCR的反应条件?
A-1:
因扩增片段的大小、反应体积、使用扩增仪器的不同而不同。
◇ 循环次数
根据模板DNA的量以及扩增片段的大小，设定25 ~ 30个循环。
如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，则会出现Smear。
◇ Anneal以及Extension
合适的Anneal温度通常在45 ~ 68℃之间 （预备实验可2℃间隔进行）。另外，由于TaKaRa LA Taq 在60 ~ 68℃间也有很高的活性, 因此可在此温度范围内设定Anneal-Extension温度, 进行2 Step PCR。Anneal-Extension温度为68℃ 时，每kbp大体可设定30秒 ~ 1分钟；当温度设定在68℃以下时, 时间设定可稍长一些。通常，Anneal温度太高，有时会得不到扩增产物；Anneal温度太低时，容易发生非特异性反应。另外，Extension时间太短时，会得不到扩增产物或者会有一些短的非特异性产物优成；而Extension时间太长时，会出现Smear。
Q-2:
选择LA PCR引物 （Primer） 时的注意事项?
A-2:
特异性非常重要。20mer左右的Primer, 如果特异性高，扩增20 kbp没有问题，但如果可能的话，建议设计30 ~ 35mer左右。使用特异性低的Primer时，会出现很多非特异性产物。
Q-3:
LA PCR时酶的使用量?
A-3:
50 μl的反应体系可使用2.5 U的TaKaRa LA Taq。但合适的用量也与模板DNA的量及Complexity、扩增片段大小有关。酶量过多时，易发生非特异性反应，出现Smear；而酶量过少时，反应性能下降。
Q-4:
LA PCR时模板DNA的调制方法?
A-4:
模板DNA的质量是LA PCR成功与否的重要因素。扩增超过10 kbp的DNA片段时，用简单的方法 （例如Cell只经过加热处理或Protease处理） 调制的DNA作模板不太合适， 建议使用充分精制的完整的DNA （没有Nick等）。
Q-5:
是否可以对λ 噬菌体直接进行LA PCR反应?
A-5:
可以。99℃、10 min处理后的噬菌体约106 ~ 107 pfu作为模板，至少可扩增8 kbp的DNA片段。
Q-6:
对Mammalian cell或E. coli 只进行热处理 （98℃， 2 min） 或Protease处理的样品可否进行LA PCR?
A-6:
◇ 对E. coli只进行热处理可扩增10 kbp的DNA片段 （50 ml PCR反应液中37℃ Overnight culture in L-both 使用2 μl）。
◇ Human细胞 （培养细胞） 如只经过热处理，可扩增数百bp；经过Protease处理、 热处理后的样品，zui多可扩增1 ~ 2 kbp。所以，如果要扩增长链DNA，建议使用经过充分精制的完整的DNA作模板。
Q-7:
使用LA Taq是否也产生A的Overhang? （PCR产物是否可直接克隆于T-vector中?）
A-7:
可以。使用TaKaRa LA Taq 及TaKaRa Ex Taq 时的PCR产物产生A的Overhang，与使用TaKaRa Taq 时的PCR产物克隆于T-vector 的效率基本相同。
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综述
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