一、放射性核素探针掺入程序 1. 探针制备
2. 缺口翻译
(1)同位素减压浓缩
取3H-dTTP(1 μC/ml)50 μl~100 μl,置入Eppendorf管中真空中减压抽干;
(2)缺口翻译反应
另取探针DNA1 μg加入Eppendorf管中,再加入10×缺口翻译缓冲液5 μl;
缺口翻译缓冲液组成为
Tris-Cl 缓冲液 0.5 M MgSO4 0.1 M
二硫苏糖醇 1 mM
牛血清白蛋白 500 μg/ml
(3)再加入dATP、dGTP、dCTP 各1 mM;用蒸馏水稀释至50 μl;
(4)混合
移入已真空干燥含有3H-dTTP的Eppendorf管中,混匀;
(5)加酶
加入DNA 聚合酶I、DNA多聚酶I各1 ml,封口;
(6)反应
16 ℃中反应10 分钟,加0.5 M EDTA终上反应;
(7)探针分离
将上述反应液加入Sephadex G50层析柱中,用TE洗脱分离。
二、探针与染色体分子原位杂交
1. 杂交液配制
3H 标记探针 1.0 μg/ml 甲酰胺 50.0 %
硫酸葡萄糖 10.0 %
EDTA 5.0 mM
聚乙烯吡咯烷酮 0.04 %
聚蔗糖 0.04 %
牛血清白蛋白 0.04 %
氯化钠 300 mM
柠檬酸钠 300 mM
磷酸盐缓冲液 20 mM
小牛胸腺DNA 50 μg/ml
以上成分相混合,pH7.0±0.1。
2. 探针变性
将杂交液混合,置于70 ℃水浴中,作用5 分钟后,再把含有杂交液的小管插入碎冰中。 3. 染色体DNA 变性
(1)在每张染色体标本上,加100 μg/ml RNA酶50 μl(为去除RNA),置一盖玻片,置于潮湿皿中,37 ℃孵育1 小时;去除盖片,浸入2×SSC 缸中漂洗4 次; (2)脱水
过70%、80%,90%、100%酒精脱水;
(3)变性
置染色体标本入2×SSC 甲酰胺溶液中,70 ℃处理2 分钟(不能过长);
(4)迅速投入30%冷乙醇溶液中;
(5)脱水
同(2);
(6)干燥
自然干燥。
4. 探针与染色体杂交
(1)每一染色体标本上加杂交液50 μl,覆一盖片;42 ℃于潮湿皿中杂交16 小时;
(2)洗脱
30~40 ℃下,50%甲酰胺溶液中洗5 次、2×SSC 溶液中洗5 次,0.1×SSC溶液洗3 次(洗脱过分影响杂交率);
(3)脱水
与前相同;
(4)干燥
自然干燥。
5. 放射自显影
(1)涂片
用国产核子乳胶(1:1)稀释液涂片; (2)曝光
4 ℃冰箱中曝光10 天后(比活性107 cpm/μg 以上),取出;
(3)显影
用D19B 显影液,显影2~5 分钟;
(4)定影
柯达F-5 定影液定影10 分钟;
(5)水洗
15 分钟。
6. 染色体显带
(1)置已曝光片子浸入下液中 Na2SO4 50.0 mM Na2B4O7 2.5 mM 37 ℃,预处理10~30 秒; (2)染色
迅速漫入10%Giemsa染色液中染2~3 分钟;
(3)水洗、干燥、镜下观察。
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