植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析
实验概要
掌握植物基因组DNA提取的一般方法及注意事项。大分子量DNA分子的酶切分析。
实验原理
十六烷基三乙基溴化胺(CTAB)是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开,然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液,再加乙醇使核酸沉淀,CTAB能溶解于乙醇。
主要试剂
1 、DNA extraction :500ml 31.885g sorbitol (山梨醇) 6.05g tris PH8.2 (一般不调)
2、Nuclei lysis buffer: 500ml 100ml 1M Tris PH7.5 100ml 0.25M EDTA 200ml 5M NaCl 10g CTAB 100ml ddH20
3、5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基钠盐) 500ml 用时,将上述三种溶液按1:1:0.4 比例混匀,加入亚硫酸氢钠(3.8g/l),65℃预热,既为抽提液。
实验步骤
一、基因组DNA提取 1、取0.15g左右小麦叶片,在液氮中迅速研磨后放入1.5ml离心管中,加入700ul抽体液(65℃预热)混匀, 65℃水浴裂解40-60 min,期间温和混匀几次,加4 ul RNase 室温静置2min。 2裂解好的DNA ,加入500 ul 氯仿:异戊醇(24:1),缓慢混匀,4℃×11 000rpm×10min。 3、取上清于新管中,(不要混入氯仿),加入0.8-1倍预冷异丙醇,缓慢混匀后再猛烈混匀,使DNA成团,-20℃静置30 min。 4、将析出的DNA 离心,4℃×11 000rpm×10 min。 5、去掉上清,将沉淀用500ul 70% 乙醇清洗一次, 6、3000 rpm×1 min, 彻底挥发除去乙醇,溶于40ul ddH2O。
二、酶切及电泳分析
管号 | ① | ② | ③ | ④ | ⑤ | ⑥ |
λ基因组DNA/μg | 1 | 1 | ||||
植物基因组DNA | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
EcoRⅠ/ ul | 1 | 2 | 2 | 2 | ||
EcoRⅠBuffer(10×) | 2 | 5 | 5 | 5 | ||
Hind III / ul | 1 | 2 | 2 | 2 | ||
Hind III Buffer(10×) | 2 | 5 | 5 | 5 | ||
ddH2O/ ul | 26 | 26 | 13 | 13 | 6 | 5 |
RNA酶 | 1 |
37℃反应4h,迅速加入2 ul EDTA中止反应。0.8%琼脂糖凝胶电泳(样品全部点样)。