circRNA/lncRNA/miRNA/ceRNA网络研究常用相关实验方法:
PCR、western blot、荧光素酶报告基因、FISH、RNA pulldown、siRNA/shRNA/病毒/sgRNA转染、
ChIP、EMSA、RIP等等。
一、ceRNA网路的一般研究思路:
分析流程如下:
![1619141857119559.jpg 1.jpg](http://www.biornscience.com/Upload/image/20210423/1619141857119559.jpg)
1、数据来源
本研究的数据来源于TCGA数据库,其中转录组数据含有癌症样本551个,癌旁样本35个;miRNA表达数据
则包括546份癌症样本和33份癌旁组织样本。
2、差异分析
有了表达数据,首先第一步就是进行差异表达分析。从转录组数据中分离出编码蛋白基因和长链非编码RNA
基因以及miRNA的表达量,针对癌症样本和癌旁组织样本进行差异表达分析,筛选差异比较大,统计显著的
差异表达分子。差异分子统计如下:
![1619141904453253.jpg 2.jpg](http://www.biornscience.com/Upload/image/20210423/1619141904453253.jpg)
差异表达基因的聚类热图和火山图如下:
![1619141925749914.jpg 3.jpg](http://www.biornscience.com/Upload/image/20210423/1619141925749914.jpg)
3、ceRNA网络构建
经过差异表达分析之后,获得了差异表达的gene, lncRNA和miRNA。需要将这三者联系起来,构建一个调控网络。
其中miRNA是关键。通过miRcode数据库预测miRNA调控的lncRNA,通过starBase、miRDB、miRTarBase 等
数据预测miRNA调控的靶基因;结合两者,最后构建一个含有97个lncRNA, 20个miRNA, 73个差异表达基因的
ceRNA网络。 将该网络进行可视化展示如下:
![1619141951136027.jpg 4.jpg](http://www.biornscience.com/Upload/image/20210423/1619141951136027.jpg)
4、ceRNA网络的拓扑结构分析
有了ceRNA网络,可以多网络的拓扑结构进行一定的分析。分别从网络节点的度,中心性和最短路径等多个网络
特征对构建的ceRNA网络进行分析,依据网络的度,筛选出那些度比较大的关键分子。其中MEG3,hsa-mir-195
,ZEB1的度都比较大。
![1619142024105617.jpg 6.jpg](http://www.biornscience.com/Upload/image/20210423/1619142024105617.jpg)
5、lncRNA与mRNA表达相关性分析
基于ceRNA网络作用的理论,受同一miRNA调控的基因和lncRNA之间应该存在正相关性。以miRNA分子
hsa-mir-195为例,研究受其调控的lncRNA和基因,构建两者的表达相关性,不少分子的相关性还是比较高的,
也说明ceRNA网络存在一定的可靠性。
![1619142053171524.jpg 7.jpg](http://www.biornscience.com/Upload/image/20210423/1619142053171524.jpg)
6、生存分析
构建出来的ceRNA网络是否真的比较关键,可以针对ceRNA网络中的lncRNA, 基因和miRNA分别进行生存分析。
基于K-M生存分析方法,发现ceRNA网络的中分子跟总生存期存在非常大的相关性。对应的生存曲线如下:
![1619142072206380.jpg 8.jpg](http://www.biornscience.com/Upload/image/20210423/1619142072206380.jpg)
7、其他数据验证
针对筛选出来的几个关键分子,采用GEO中的芯片数据,验证一下这些筛选出来的分子是否正确。分别比较这些分
子在癌症组织和乘车组织中的表达水平,发现这些分子表达水平在不同组织中的确存在非常大的差别。
![1619142101529721.jpg 9.jpg](http://www.biornscience.com/Upload/image/20210423/1619142101529721.jpg)
8、功能分析
针对ceRNA网络中编码蛋白的基因,还可以研究这些基因的分子功能。分别从GO,KEGG富集等方面了解这些基因的
功能。
从这些注释信息来看,这些基因对应的分子功能还是跟癌症的信号通路相关的。也说明这个网络能解释一些癌症发
病的原因。
![1619142135103934.jpg 10.jpg](http://www.biornscience.com/Upload/image/20210423/1619142135103934.jpg)
二、研究常用实验ChIP、RIP、RNA pull-down、EMSA、荧光素酶报告基因的比较
ChIP:通过与染色质片段共沉淀和PCR技术,在体内检测与特异蛋白质结合的DNA。将处于适当生长时期的活细
胞用甲醛交联后将细胞裂解, 染色体分离并打碎为一定大小的片段200bp-1000bp;然后用特异性抗体免疫沉淀目标
蛋白与 DNA交联的复合物, 对特定靶蛋白与DNA进行富集。采用低pH值条件反交联, DNA与蛋白质之间的 Schiff
键水解, 释放DNA。通过对目标片段的纯化与检测,获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。
研究目的:蛋白与DNA结合情况。
RIP:RIP技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉淀),是研究细胞内RNA
与蛋白结合情况的技术。运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化就可以
对结合在复合物上的RNA进行分析;即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白,防
止非特异性的RNA的结合,免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来,结合的RNA序列通过
microarray (RIP-Chip),定量RT-PCR或高通量测序(RIP-Seq)方法来鉴定。是了解转录后调控网络动态过
程的有力工具,能帮助我们发现miRNA的调节靶点。
研究目的:蛋白与RNA结合情况。
RNA pull-down:使用体外转录法标记生物素RNA探针,然后与胞浆蛋白提取液孵育,形成RNA-蛋白质复合物。
该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合,从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后,通过western blot
实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。
研究目的:蛋白与RNA结合情况。
EMSA:凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)是一种研究DNA结合蛋白
和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用、DNA
定性和定量分析。生物素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。
研究目的:蛋白与DNA结合情况。
荧光素酶报告基因:荧光素酶的基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中,将不同类型的细胞(干细胞
、T细胞等)标记上(即表达)荧光素酶,就可以用高敏感度的CCD相机进行对动物体内进行活体观察而不会伤
害到动物本身。在荧光素酶中加入正确的萤光素底物就可以放出荧光,而发出的光子可以被光敏感元件,如萤光
探测器或改进后的光学显微镜探测到。这就使得对包括感染在内的多种生命活动进程进行观察成为可能。
研究目的:启动子激活情况。
三、研究常用实验siRNA、shRNA的选择
研究基因的功能,科研工作者通常从两方面着手:功能获得性和功能丧失性。而RNAi技术就是功能丧失性研究
的一种。它是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象,当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA
(dsRNA)时,该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。它是研究转录后调控的有效工具,可用于功能基因组
研究以及基因治疗等临床应用。
近年来,RNAi已成为研究基因功能不可或缺的工具。其应用领域已经从基因组学研究逐步扩展到医学领域并作为
基因治疗手段。RNAi作为这么重要的分子生物学技术,其原理如何?如下图所示:外源dsRNA进入细胞后在
Dicer酶的作用下产生双链siRNA,双链siRNA解旋后,其反义链和多种核酸酶形成了沉默复合物
(RNA-induced silencing complex,RISC),RISC具有结合和切割mRNA的作用,从而介导RNA干扰的过程。
![1619142224116185.jpg 11.jpg](http://www.biornscience.com/Upload/image/20210423/1619142224116185.jpg)
根据RNAi的作用机制,RNAi实验的研究步骤大体分为4步,详见下图:
![1619142244154139.jpg 12.jpg](http://www.biornscience.com/Upload/image/20210423/1619142244154139.jpg)
除了化学合成siRNAs外,博恩生物可以提供Vector-based shRNAs构建、导入细胞和抑制效果验证服务,功能验
证服务需要根据客户的实验需求进行现场评估。RNAi的效应分子是siRNA。不管您选择什么干扰方式,最终均会形
成siRNA,然后与RISC多蛋白复合物组装成有活性的RISC,发挥基因沉默功能。shRNA(short hairpin RNA),
即短发卡RNA,是可以clone至表达载体并表达siRNA双链的RNA分子;siRNA(small interfering RNA),即小干
扰RNA,是21-23nt的双链RNA复合物,每条链的3’端有2-3个突出的非配对碱基且3’端为羟基,5’端为磷酸,
这个结构具有能被Rnase Ⅲ样活性的核酸酶识别切割的特征,从而引发高度保守的Dicer 家族的RNaseⅢ的识别作
用进而特异切割dsRNA产生基因沉默作用。下面是siRNA(上图)和shRNA(下图)的结构示意图:
![1619142274123841.jpg 13.jpg](http://www.biornscience.com/Upload/image/20210423/1619142274123841.jpg)
siRNA与shRNA都可以有效沉默或抑制目标基因的表达,但是作用机制还是有一些区别的,具体内容详见下图:
![1619142291116203.jpg 14.jpg](http://www.biornscience.com/Upload/image/20210423/1619142291116203.jpg)
siRNA和shRNA的区别: 这里需要特别注意,当RNA不在细胞质而在细胞核时,一般需要选择sgRNA进行敲除或
敲入,这个时候shRNA、siRNA由于无法进入细胞核,因此都无法实现敲减。
![1619142319186284.jpg 15.jpg](http://www.biornscience.com/Upload/image/20210423/1619142319186284.jpg)
四、研究常用实验三种病毒的选择
1、慢病毒(Lentivirus)
慢病毒(lentivirus)是逆转录病毒的一种,是RNA病毒,需要相对较长的孵育时间,所以称之为“慢”病毒。
慢病毒区别于一般的逆转录病毒,它可以感染分裂和非分裂细胞,并能将外源基因整合到宿主基因组上实现长期
稳定的表达,是体外和体内基因传递的有效工具。
1)LV结构
慢病毒是一种有包膜的RNA病毒,直径为80-120nm,呈二十面体对称结构、球形。病毒颗粒最外层是包膜(包膜蛋白
决定了感染细胞的类型),再往里依次为基质蛋白和衣壳,最里面是两条相同的正股RNA链和酶(逆转录酶、整合酶
和蛋白酶)。
下图是慢病毒的结构示意图:
![1619142351224625.jpg 16.jpg](http://www.biornscience.com/Upload/image/20210423/1619142351224625.jpg)
2)LV特点
1. 慢病毒有广泛的宿主范围,能够有效地感染分裂细胞、非分裂细胞,特别适合于一些难转染的细胞(如原代细胞、
干细胞、不分化的细胞)和对腺病毒感染具有较强免疫反应的细胞(如树突状细胞、单核细胞和间充质干细胞)等,
能大大提高目的基因转导效率,而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加。
2. 慢病毒能将外源基因有效地整合入宿主染色体上,介导目的基因稳定、长期的表达。因此,可以利用慢病毒建立
稳定细胞株。
3. 适用范围更广,不仅能用于体外实验,还能用于活体动物模型,尤其是动物成瘤实验。
2、腺病毒(Adenovirus)
腺病毒(Adenovirus,Ad)是一种无包膜的DNA病毒,其copy不依赖于宿主细胞的分裂。腺病毒拥有近50个血清型,
大多数腺病毒载体都是基于血清型2和血清型5,通过转基因的方式取代E1和E3基因,降低病毒的copy能力。这些重
组病毒仅在高水平表达E1基因的细胞中copy,因此是一种适用于治疗的高效控制系统。重组腺病毒是进行基因转移
和表达的工具,功能强大并易于操作。腺病毒独特的生物学特征使它成为载体的较好选择,被科研工作者广泛使用。
1)AdV结构
腺病毒是一种直径为90-100nm的病毒颗粒,衣壳呈廿面体,由240个六邻体和12个五邻体组成。以五邻体蛋白为
基底由衣壳表面伸出12根纤毛,纤毛顶端形成头节区。五邻体和纤毛的头节区可与细胞表面的受体结合,在病毒感
染细胞过程中起着非常重要的作用。
下图是腺病毒的结构示意图:
![1619142385817517.jpg 17.jpg](http://www.biornscience.com/Upload/image/20210423/1619142385817517.jpg)
2)AdV特点
1、腺病毒感染的宿主细胞范围广,包括分裂细胞和不分裂细胞(某些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞除外)。
2、腺病毒感染效率高,在感染条件下,感染率可达100%。
3、腺病毒的病毒滴度可以很高,纯化、浓缩后可达1012-13vp/ml(即1010-11pfu/ml)。
4、腺病毒易于扩增,而其他病毒比如慢病毒和腺相关病毒需要重新包装。
5、不整合到染色体中,无插入致突变性。
6、腺病毒理化性质稳定,4℃:数周。-80 ℃:数年。
3)AdV种类
![1619142404120587.jpg 18.jpg](http://www.biornscience.com/Upload/image/20210423/1619142404120587.jpg)
3、腺相关病毒 ( adeno-associated virus,AAV)
腺相关病毒(Adeno-associated virus)属于细小病毒科,Dependoparvovirus属,是目前发现的一类结构简单、无
包膜的单链DNA缺陷型病毒,它的生命周期依赖于copy病毒的参与,如腺病毒和单纯疱疹病毒。野生型的腺相关病毒
可以定点整合到人类第19号染色体的AAVS1位点,而重组腺相关病毒由于缺少整合和copy必需的两个基因而无法整合。
因此,重组腺相关病毒主要以游离于染色体的附加体形式存在,并可长时间存在于非分裂细胞中。另外,腺相关病毒具
有高组织特异性、良好的扩散性、低免疫原性、高安全性和稳定性。基于以上特点,重组腺相关病毒已经成为科研和基
因治疗中具市场前景的病毒载体之一。
AAV血清型
现阶段研究人员已发现12种人类AAV 血清型(AAV1至AAV12)和 100多种非人类灵长动物AAV血清型。不同AAV血
清型具有不同的衣壳蛋白空间结构、序列和组织特异性,因而其识别与结合的细胞表面受体也相应有很大差别,这也导
致不同血清型转染的组织类型、细胞类型和感染效率也各不相同。表一是人类AAV1至AAV9识别的细胞表面受体;
表二是AAV1至AAV9的不同组织亲噬性。
![1619142470474941.jpg 19.jpg](http://www.biornscience.com/Upload/image/20210423/1619142470474941.jpg)
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![1619142500700299.jpg 23.jpg](http://www.biornscience.com/Upload/image/20210423/1619142500700299.jpg)
![1619142508582435.jpg 24.jpg](http://www.biornscience.com/Upload/image/20210423/1619142508582435.jpg)
五、研究常用生信网站:
分子机制示意图制作网站:www.biorender.com/
转录因子分析、基因功能分析、表达分析网站:www.gcbi.com.cn/gcuser/html/auth/login?source=generadar
lncRNA亚细胞定位预测网站:www.rna-society.org/rnalocate/index.html
miRNA分析网站:www.mirbase.org/
非编码RNA分析网站:www.noncode.org/
最全的蛋白功能、信息网站:www.uniprot.org/
lncRNA功能分析网站:diana.e-ce.uth.gr/lncbasev3/home
ceRNA网络分析网站:starbase.sysu.edu.cn/
miRNA分析网站:mirdb.org/
m6a甲基化预测网站:www.cuilab.cn/sramp
转录因子预测网站1:www.generegulation.com
转录因子预测网站2:jaspar.genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.pl
ceRNA网络/lncRNA/circRNA/miRNA研究价格
ceRNA网络/lncRNA/circRNA/miRNA研究信息由南京博恩生物技术有限公司为您提供,如您想了解更多关于ceRNA网络/lncRNA/circRNA/miRNA研究报价、型号、参数等信息,欢迎来电或留言咨询。