技术简介

近年来，科学家们首次发现了一种可逆的RNA甲基化—m6A，即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上发生甲基化修饰(N6-methyladenosine，m6A)。研究发现，m6A是真核生物mRNA上最常见的一种转录后修饰，m6A在细胞加速mRNA代谢和翻译，以及在细胞分化、胚胎发育和压力应答等过程中起重要作用。种种研究迹象表明m6A 存在于很多物种中，占到了 RNA甲基化修饰的80%。m6A除了分布在 mRNA 中，也出现在很多非编码 RNA中 ，如：环状RNA 、LncRNA等。Nature正刊发表文章，证实发生m6A RNA甲基化修饰可以调控mRNA稳定性。而随后Cell Research也发表文章，证实环状RNA也会被m6A甲基化修饰，并会促进环状RNA编码蛋白这一有趣的结论。

　　 云序生物(m6A)RNA甲基化测序流程

云序生物RNA甲基化测序产品

云序优势

一站式服务：

客户只需提供细胞、组织或RNA，云序生物为您完成从MeRIP富集，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。

优化的实验流程：

MeRIP的富集效率是决定数据质量的关键，云序生物MeRIP实验采用预验证的商业化抗体和精心优化的实验流程，具有极高的效率和特异性。

严格的质控：

云序生物对MeRIP实验的各个关键步骤进行严格的质控，全程***实验质量，确保客户得到优质的数据。

专业的生物信息学分析：

云序生物具有强大的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析需求。

特异性高：

通过抗体特异性富集发生甲基化修饰的RNA片段，以较低的成本实现转录组范围的RNA甲基化研究。

样本要求：

样品类型：

细胞、组织或基因组RNA，其他样本类型请电询。

样品量：

a) 细胞：1×10⁸

b) 组织：5 g

c) RNA：300 μg (OD260/280：1.6-2.3; RNA无明显降解; 28S:18S>1.5或RIN>7)

样品运输及保存：

样品运输：样品置于1.5mL离心管中，封口膜封好，干冰运输。

样品保存：细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮冻存后-80℃保存;RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80℃保存，避免反复冻融。

数据分析

1. 识别甲基化富集峰

通过高通量测序和生物信息分析，识别(p <10^-5)甲基化富集的基因组区域。

              

注：每个样品组做一个Input，以去除基因组背景，降低假阳性率

2. RNA甲基富集峰注释

通过生物信息分析利用最邻近基因对富集峰进行注释，并根据峰中点相对于已知基因的位置，将富集峰为启动子峰、上游峰、内含子峰、外显子峰、基因间峰。

3. RNA甲基化富集峰区域的在基因组中的分布

根据注释信息，绘制富集峰在不同基因组特征上的比例图。

4. RNA甲基化位点Motif分析

RNA上甲基化的位点，可能包含某种序列motif。RNA甲基化酶可能正是通过识别这些motif特异性进行甲基化修饰，从而完成转录后调控功能。我们成功识别了全基因组的RNA上的甲基化位点后，获取序列就能使用生物信息学的手段来搜索这些motif，从而揭示RNA甲基化修饰的机制。

5. 差异RNA甲基化区域的识别与聚类

云序生物使用 diffReps 软件进行差异甲基化位点的识别。默认筛选标准为 FDR<=0.05，具体以报告为准。 识别样本间的差异甲基化区，发现与特定表型或疾病相关的甲基化区域。

6. 差异甲基化区的GO与信号通路分析

对差异甲基化基因进行功能分类，并发现显著性富集的功能条目。

7. Reads 的分布

使用 ngs.plot 工具可以展示匹配 reads 在 TSS， genebody， TES 等位点的分布情况，可以用来观察 RNA 甲基化对TSS 等位点是否有偏好。

案例分析

原文：Transcriptome-wide high-throughput deep m6 A-seq reveals unique differential m6 A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana

期刊：Genome Biology 影响因子：13.21

西北农林科技大学联合中科院和普渡大学，借助m6A RNA甲基化测序技术，对比拟南芥花，叶，根组织中（每种组织有两个生物学重复）m6A RNA甲基化情况。结果发现检测组织中m6A RNA甲基化修饰程度比人类高10%左右，占转录组的83%。

图1. 比较拟南芥花，叶，根组织中m6A RNA甲基化情况

案例2：不同品系拟南芥m6A RNA甲基化谱 

原文：Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana

期刊：Nature communications 影响因子：12.12

芝加哥大学联合北大，利用m6A RNA甲基化测序对比和品系拟南芥根组织中m6A RNA甲基化谱，发现的分布在两个品种间高度保守。与人类m6A RNA甲基化位点分布情况相比，拟南芥甲基化位点在起始翻译区特异性高表达。

图2. 不同品系，同一基因上甲基化 

案例3：m6A RNA去甲基化酶ALKBH5通过结合lncRNA促进胶质瘤细胞

原文：m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program 

期刊：Cancer Cell 影响因子：27.43 

世界卫生组织将胶质瘤分为四级，其中恶性胶质瘤(GBM)属于最危险的第四级，手术治疗和化疗都难以避免其高复发率。近年来，m6A RNA修饰的研究已成为当今生命科学领域最前沿研究之一，不断有高分文章问世。m6A RNA修饰的催化、去除以及识别的分子机理研究越来越清晰，此时人们更关心m6A RNA修饰与重大疾病之间的相关性。近期Cancer Cell报道了m6A RNA去甲基化酶ALKBH5在神经胶质瘤中具有生理作用。在本研究中，去甲基化酶ALKBH5在恶性胶质瘤干性样细胞表达上调，而ALKBH5高表达的胶质细胞瘤患者预后生存率更差。通过敲低ALKBH5，meRIP鉴定m6A RNA甲基化修饰模式，基因芯片检测差异表达>2倍的基因，最终筛选到与细胞周期调控相关的FOXM1基因，其在GSCs的自我修复和肿瘤形成中起到关键作用。ALKBH5促使癌基因FOXM1转录本去甲基化，增加FOXM1表达。随后作者发现FOXM1反义长链非编码RNA——FOXM1-AS(LOC100507424)，与FOXM1 mRNA最后一个外显子有457个核苷酸互补。结果证实ALKBH5和FOXM1-AS可与FOXM1协同作用，发挥促进恶性胶质瘤肿瘤形成作用。 

             图3. ALKBH5和FOXM1-AS可与FOXM1协同作用，促进恶性胶质瘤肿瘤形成