慢病毒，一个强大的转基因及基因调控工具。它可以帮助实现很多复杂的基因调控。把它用好，能让您对目的基因的功能了解的更透彻。KnockGene擅长，根据您的课题需求，设计构建多方位研究基因功能的慢病毒载体。好的载体，让您的后续实验高枕无忧。

我们可为您设计，有以下要求的载体：

u  过表达，调控表达（对表达量有比较严格的要求）

u  敲低，RNAi，CRISPR

u  稳定转染，永久转染，传代细胞转染，原代细胞转染，在体转染

u  单载体CRISPR

u  多基因表达，长ORF

u  组织特异性表达，靶向性转染，cell targeting

u  非整合型慢病毒

u  全实验过程中涉及多个筛选基因的设计

u  全实验过程中涉及多个报告基因的设计

u  基因治疗载体的优化

除了设计各种难以程度不同载体之外，我们也乐于为大家提供实验方面的咨询，分享我们团队十多年来在各类实验中积累的经验，帮助大家克服实验中遇到的问题。欢迎联系：

案例1 端粒酶逆转录酶（TERT）的表达

端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase, TERT）编码端粒酶的一个催化亚基，功能在于在染色体端粒末端加入特定的核苷酸序列，从而防止染色体在复制过程中发生降解。在细胞内表达TERT是一种诱导细胞永生化的方法。

客户需求：构建表达人TERT基因的病毒质粒，并制备病毒转染原代细胞。

难点：人TERT基因编码区为3396bp，基因本身比较大，通常构建到慢病毒载体中后，由于载体太大，包装的病毒滴度比较低，用于转染原代细胞会比较困难。

结果：使用我们的病毒载体构建了TERT的表达质粒，TERT基因由CMV启动子驱动表达，载体中带有puromycin抗性基因用于转染后筛选。由于我们的病毒载体较小，装入TERT基因后并未对病毒包装造成太大的影响，包装的初始病毒滴度可以达到10⁶TU/ml以上，浓缩后可以达到10⁸ TU/ml以上，客户拿到病毒以后顺利完成细胞转染以及筛选，获得了稳定表达TERT基因的细胞。

案例2  超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4（HCN4）的表达

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4（HCN4）主要存在于心肌细胞上，在控制心率中起着比较重要的作用，在心律失常的研究中经常被涉及。

客户需求：已经在其他公司构建了HCN4的表达病毒载体，但是只带有GFP标记，而且GFP荧光较弱，不便于筛选，希望能够改进。

难点：HCN4本身基因长度有3606bp，在这种情况下加入GFP标记并且成功包装出病毒已经不太容易，要提高荧光强度并且再加入筛选标记更加困难。

结果：使用我们的病毒载体构建了双启动子的HCN4表达质粒，将HCN4和标记基因用不同的启动子表达。此载体带有GFP便于观察，带有puromycin便于筛选。载体已经很大，并且确实对病毒滴度也造成了一些影响，包装的初始病毒滴度在5*10⁵左右，经过浓缩以后，仍然完全满足客户的需求，成功进行了原代细胞转染。

案例3  有表达水平需求的双基因表达

客户需求：客户自己提供两段基因序列，需要在同一个载体上进行表达，并且不需要表达量太高，两个基因表达强度不要相差太大，需要带有筛选标记。

难点：同时表达两个基因，加上一个筛选标记基因，总共3个基因，本身难度不大。但是客户需要目的基因维持在一个较低的水平，就比较难于控制。

结果：针对这一要求，我们构建了双向启动子的表达病毒载体，两个目的基因由双向启动子驱动表达，抗性基因单独表达。由于客户其他载体上已经使用了puromycin和Blasticidin的抗性，这个载体选择了用Neomycin进行筛选。此载体病毒包装完全正常，转染细胞以后表达也符合客户的要求。

案例4 原代造血干细胞中CRISPR基因敲除

客户需求：在分离的原代造血干细胞中，使用CRISPR技术敲除掉目的基因，并且要尽可能的花更少的时间完成这一目的。

难点：   CRISPR的慢病毒由于Cas9基因本身比较大，达到4100bp以上，因此通常是采用双病毒载体，一个载体表达Cas9，另一个载体表达sgRNA，对细胞转染两次以后才能完成基因敲除。对于原代造血干细胞来说，本身体外培养时间有限，前面两次转染和筛选会消耗大量的时间，使得后面没有足够的时间完成实验。有一些慢病毒载体可用于单载体CRISPR应用，例如常见的LentiCRISPRv2，但是这些载体包装的病毒滴度太低，通常只有10⁵TU/ml量级，对于本来难转的原代细胞就很麻烦。

结果：使用我们独有的单载体CRISPR，构建了两个靶点的病毒载体，并且包装病毒。初始滴度均能达到10⁶ TU/ml以上。浓缩以后能够成功的转染细胞，使用载体带有的puromycin抗性进行筛选，获得稳定转染敲除病毒的细胞。在转染后7天的时候取细胞进行WB分析，两个靶点均有效的完成了目的基因的敲除，分别达到70%和90%以上。此载体在不需要单克隆筛选的情况下即完成了基因敲除，使这些难于实现的实验变得可行。

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